給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進(jìn)入實驗室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實驗材料

（1）藥品與試劑：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多巴胺（DA）、乙酰膽堿（Ach）、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）來自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美國莫州）。 （2）儀器： ① 行為學(xué)檢測：水迷宮儀器 ② 機制檢測：全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。2 評價方法 （1） 行為學(xué)評價: ① 大鼠水迷宮實驗 水迷宮實驗（Morris Water Maze test, MWM test）采用大鼠水迷宮計算機圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)進(jìn)行。大鼠水迷宮為直徑180cm，高60cm 圓形的水池。在水池壁上標(biāo)明4 個點，并據(jù)此將水池分為四個象限，于其中一象限中心置一直徑為10cm，高30cm 的鐵質(zhì)圓形平臺，水面高于平臺1cm，水溫控制在(25±2)℃。水迷宮測試分為兩個階段，即①定位航行實驗，歷時5 天，每只動物每天3 個象限（實臺象限除外），將大鼠面向池壁放入水中，記錄1.5 min 內(nèi)尋找平臺所需時間(尋臺潛伏期)。若大鼠入水后1.5 min 內(nèi)未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留30s，尋臺潛伏期記錄為1.5 min。② 空間探索實驗，定位航行實驗結(jié)束后撤除平臺，將大鼠面向水壁從對角象限入水放入池內(nèi)，記錄1.5 min 內(nèi)，動物在實臺象限的游程、時間等指標(biāo)。

② 小鼠避暗實驗

避暗實驗前一天，將動物頭部背向電動門自明室放入，任其在明暗室內(nèi)自由活動以熟悉環(huán)境。5 min 后，取出，放回原籠。實驗分為記憶獲得和鞏固兩個階段，均于給藥1 小時后開始檢測。記憶獲得階段：將動物頭部背向電動門自暗室放入，暗室電壓幅度為39v。檢測時間為5 min。軟件自動記錄5 min內(nèi)錯誤次數(shù)、暗室時間及暗室路程。24 小時后，進(jìn)行記憶鞏固實驗：將動物頭部背向電動門自明室放入，即開始實驗，電壓幅度為39 v。軟件自動記錄5 min 內(nèi)錯誤次數(shù)、入暗潛伏期、暗室時間及暗室路程。

③皮毛狀態(tài)測試

皮毛狀態(tài)測試在實驗前及應(yīng)激刺激結(jié)束后各測試一次。皮毛狀態(tài)測試部位包括頭、頸、背部、腹部、前后爪、尾巴、生殖器七個部位。皮毛整潔，計0分，皮毛臟亂，計1分。皮毛狀態(tài)指數(shù)=計分總數(shù)/部位數(shù)。

2 機制的檢測

①CUMS對大鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測

采用實驗室前期的實驗方法-LC-MS/MS進(jìn)行測定。

色譜條件：色譜柱為 TSK-GEL Amide-80，柱溫35 ℃；以乙腈–水 (含6 mM HCOONH4)（67.5 : 32.5）為流動相，0.2 mL/min 流速。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源；正離子模式檢測；電噴霧電壓為4500V；信號采集方式為多反應(yīng)檢測（MRM）；GS1：50 psi；GS2：50 psi；TEM：450℃。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 DA， NE，5-HT，Ach，GABA，Glu，DHBA 各 1 mg，用含0.2% 甲酸的甲醇：水(1：1)配制成 1 mg/mL 的儲備液（-80℃保存），臨用前分別吸取各神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲備液20 μL，加入860 μL 含 0.2% 甲酸的甲醇水（1:1），配制成20 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋混勻，然后分別稀釋至1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2，0.1 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋后每200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入300 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL。標(biāo)準(zhǔn)溶液均在臨用前配制。

測定方法：組織稱重，向EP 管中加入200 μl 純水。用超聲破碎儀進(jìn)行勻漿，后加入400 μL含0.2%甲酸乙腈，放于-20℃冰箱內(nèi)過夜。次日從冰箱內(nèi)取出樣品，在4℃離心12000r/min，10min，各取上清液200 μL，加內(nèi)標(biāo)20μL(300μg/mL DHBA)，將樣品50μl 注入LC-MS/MS 進(jìn)行分析。

②CUMS對小鼠神經(jīng)遞質(zhì)檢測

方法同大鼠。

統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用SPSS 22. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）形式表示。采用one-way ANOVA 進(jìn)行組內(nèi)比較，使用最小顯著差數(shù)法（LSD）多重比較方法比較兩組間差異，當(dāng)P <0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3. 結(jié)果

（1）CUMS對大鼠的影響

① CUMS對大鼠體重的影響

CUMS 模型組大鼠在應(yīng)激發(fā)生第2、3、4、5 周后體重較正常組明顯下降（P<0.01）。西酞普蘭組未能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激因素導(dǎo)致的體重下降。

② CUMS對大鼠水迷宮的影響

前5天的定位航行中，CUMS大鼠從第二天起尋臺潛伏期比正常大鼠長（P<0.05）。在第六天的空間探索實驗中CUMS大鼠與正常大鼠相比，跨平臺位置次數(shù)明顯減少（P<0.05）。

（2）CUMS對小鼠的影響

①CUMS對小鼠體重的影響

隨著應(yīng)激時間的延長，CUMS模型組體重增加緩慢，第5周時，模型組體重明顯下降，與正常組相比，具有顯著性差異。

③ CUMS對小鼠避暗實驗的影響

結(jié)果顯示，避暗實驗記憶鞏固階段，CUMS模型小鼠入暗次數(shù)及在暗室中的時間和路程均明顯增加，與正常組相比，具有顯著性差異（P<0.01）。圖3 CUMS模型對小鼠避暗實驗的影響（mean±SEM ，n=12，**p<0.01，與正常組比較） （3）機制檢測結(jié)果 ① CUMS對大鼠前額皮層組織神經(jīng)遞質(zhì)的影響

CUMS 模型組前額皮層5-HT含量較正常組明顯下降（P<0.01），模型組前額皮層NE含量較正常組明顯下降（P<0.05）

1 動物：雄性Wistar 大鼠，180-220 g，SPF 級。分為空白對照組、CUMS模型組，每組10只。 雄性 BALB/c 小鼠，26-28 g，SPF 級，分為空白對照組、CUMS模型組，每組12只。

2 模型誘導(dǎo)方法：

（1）大鼠慢性不可預(yù)測性應(yīng)激模型的建立

在本課題組前期CUMS應(yīng)激方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。除正常對照組外，其余大鼠每日隨機接受各種不同的應(yīng)激源的刺激，包括：應(yīng)激因素包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、強迫游泳（25℃，20 min 或10 ℃，5 min）、噪聲3 小時、行為限制（使用自行研發(fā)的大鼠行為限制器，長20cm, 直徑7 cm），配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。應(yīng)激時間為5 周，每日2-3 種，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點，避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。末次給藥后進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)檢測，并取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢測。模型組單籠飼養(yǎng)，正常組大鼠群養(yǎng)，每籠5 只，并放置另外房間飼養(yǎng)。

（2）小鼠慢性不可預(yù)測性應(yīng)激模型的建立

應(yīng)激因素包括：禁食、禁水、強迫游泳，配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠、晝夜顛倒等。應(yīng)激時間為5 周，每日2-3 種，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點，避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。具體刺激時間同大鼠（表1）

Katz[1]等在20世紀(jì)80年代早期開始慢性應(yīng)激模型的研究，連續(xù)三周給予動物一系列高強度刺激因素如電擊、冰水游泳等，動物呈現(xiàn)抑郁狀態(tài)。Willner[2]等在此基礎(chǔ)上，降低了應(yīng)激刺激的強度，延長應(yīng)激時間，并將快感缺失測試作為該模型的主要評價方法，形成了慢性不可預(yù)測性溫和應(yīng)激模型（CUMS）。應(yīng)激因子包括晝夜節(jié)律的調(diào)整和光照性質(zhì)的改變( 閃光、間斷光照)、食物和飲水的調(diào)整、環(huán)境的改變( 鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊足底、游泳等。應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)測性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。研究發(fā)現(xiàn)，CUMS能夠造成小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙[3]。

因此，本研究聚焦于CUMS對老鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，采用Morris 水迷宮檢測慢性應(yīng)激對大鼠依賴性空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；采用避暗行為學(xué)檢測慢性應(yīng)激對小鼠記憶的獲得、鞏固、再現(xiàn)等過程。慢性應(yīng)激對于Morris 水迷宮的影響，研究報道不盡一致。有研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能[4]。有報道認(rèn)為，慢性應(yīng)激可促進(jìn)動物在Morris 水迷宮測試中的學(xué)習(xí)記憶功能[5]。本研究采用Morris 水迷宮檢測慢性應(yīng)激對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。避暗實驗是利用嚙齒類動物趨暗避明的習(xí)性設(shè)計，動物進(jìn)入暗室即遭足底電擊，反復(fù)數(shù)次后形成條件反射[6]。這種厭惡性條件反射形成快且恐懼記憶持續(xù)時間長，是較為敏感的學(xué)習(xí)記憶評價方法。本研究利用避暗實驗評價CUMS 小鼠模型的認(rèn)知功能損傷。

目前，文獻(xiàn)報道的CUMS刺激因子刺激因子的多變性、不可預(yù)見性是模型成功的關(guān)鍵，單獨使用一種刺激不能產(chǎn)生理想的效果，每種刺激因子應(yīng)間隔3～7 d[7]，大部分CUMS造模過程都選擇了7-11種刺激因子，只有少數(shù)實驗選擇了≥12或≤6種的刺激因子，最少的用了4種，最多的用了14種。造模周期有2-8周不等，其中以3-6周最為常見。本模型選用適宜的造模時間-35天，以及常用的幾種刺激因子，確定該模型誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型為現(xiàn)代人類長期處于慢性不可預(yù)測應(yīng)激作用下誘發(fā)的學(xué)習(xí)記憶減退機理研究、防護(hù)和藥物研究提供實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

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