常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般都有對應(yīng)的白變種品系，如BALB/c小鼠、SD大鼠、白化豚鼠、新西蘭大白兔等，能滿足特定實(shí)驗(yàn)需求。為了更好地使西藏小型豬滿足科研實(shí)驗(yàn)需求，本單位通利用CRISPR/Cas9受精卵注射法獲得了TYR基因敲除白化西藏小型豬。該方法可有效避免了體細(xì)胞核移植法所引起的胚胎發(fā)育延遲、出生后存活率低、同一細(xì)胞克隆株所獲得的性別單一等問題。此外，受精卵由胞質(zhì)內(nèi)注射法所獲得的F0代并不攜帶外源豬種的線粒體DNA，很好地保留了西藏小型豬的其他特性。外觀上看，白化西藏小型豬和普通西藏小型豬，除了眼睛和皮毛發(fā)顏色不一樣外，其他無太大差別。TYR基因敲除西藏小型豬，因黑色素合成障礙，導(dǎo)致全身皮膚和毛發(fā)呈白色，眼睛呈紅色，呈典型的白化癥狀。與野生型西藏小型豬相比，白化西藏小型豬的耳緣靜脈更加清晰，利于實(shí)驗(yàn)時(shí)靜脈注射給藥。白化西藏小型豬的皮膚在進(jìn)行炎癥和損傷觀察時(shí)更加清晰，且還可很方便地在其皮膚或毛發(fā)上做標(biāo)記。

由于白化病為隱性遺傳病，白化個(gè)體并不攜帶野生型TYR等位基因，白化個(gè)體間交配繁殖只能生出白化個(gè)體，育種相對方便。白化突變動(dòng)物通常在野生自然環(huán)境下會因長期受到太陽紫外線照射引起損傷或癌變，而容易被自然選擇淘汰。為了驗(yàn)證TYR基因敲除白化西藏小型豬是否適合培育成實(shí)驗(yàn)用小型豬新品系，我們對其一些常用指標(biāo)進(jìn)行了檢測。目前已通過TYR敲除的F0代間交配繁殖目前已獲得了F1代、F2代、F3代TYR基因敲除白化西藏小型豬。

白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的各體尺指標(biāo)之間無明顯差異，表明了白化西藏小型豬與同齡的普通西藏小型豬的體型相近，二者的生長發(fā)育速度保持一致。同時(shí)也表明了白化西藏小型豬在普通飼養(yǎng)環(huán)境能正常生長發(fā)育。通過分析和比較白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的繁殖性能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)它們的繁殖性能相似，說明白化小型豬在普通飼養(yǎng)環(huán)境下能正常繁殖，不受TYR基因失活的影響。

初步統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)白化西藏小型豬的血液生理指標(biāo)與普通西藏小型豬的血液生理指標(biāo)絕大部分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不過白化西藏小型豬的MCHC略高于普通西藏小型豬的MCHC。但由于動(dòng)物的血液生理學(xué)指標(biāo)也會因年齡、性別、營養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)等而有所差異的。總體來說，白化西藏小型豬的血液生理指標(biāo)與普通西藏小型豬的血液生理指標(biāo)基本一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TYR基因功能失活的白化西藏小型豬，除了皮毛和眼睛顏色與普通正常西藏小型豬不一樣外，各項(xiàng)體尺指標(biāo)、繁殖性能指標(biāo)、血液生理和生化指標(biāo)等與普通西藏小型豬的對應(yīng)指標(biāo)基本保持一致。TYR基因敲除白化西藏小型豬能在普通級動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境下很好地存活和繁殖。白化西藏小型豬由于皮膚和毛發(fā)白色，更利于耳緣靜脈給藥和皮膚實(shí)驗(yàn)的觀察。此外也可作為白化病大動(dòng)物模型進(jìn)一步研究。我們認(rèn)為TYR基因敲除白化西藏小型豬適合用作實(shí)驗(yàn)小型豬新品系，滿足科研實(shí)驗(yàn)需求。

酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬是通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除TYR基因而獲得的，沒有插入任何外源基因，為非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。獲得的白化西藏小型豬由于是通過受精卵胞質(zhì)注射法而制備的，不攜帶異種品系豬的線粒體DNA——母系遺傳物質(zhì)，能保持品系的純正。所用的受精卵均通過手術(shù)體內(nèi)沖卵獲得，沒有到屠宰場采集卵巢和卵母細(xì)胞，生物安全可控。TYR突變引起的白化為隱性性狀，可通過白化藏豬之間交配繁殖保種，得到的后代均為白化，能穩(wěn)定遺傳。白化藏豬在普通實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境能正常繁殖存活，但在野外環(huán)境會受到長時(shí)間太陽紫外線照射而引起皮膚損傷，且沒有原有保護(hù)色容易被天敵發(fā)現(xiàn)和捕殺，野生條件下不易存活，生物安全性高。

4.1 評價(jià)與驗(yàn)證方法

4.1.1 TYR基因突變檢測

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和DNA桑格測序（DNA sanger sequence）方法對西藏小型豬的基因型進(jìn)行鑒定。一般從豬耳朵上剪取小量的皮膚組織提取DNA。若要進(jìn)一步鑒定嵌合體，要從不同部分剪取組織提取DNA進(jìn)行鑒定。已達(dá)性成熟的公豬可采集少量的精液提取精子總DNA來鑒定靶點(diǎn)基因是否存在生殖遺傳突變。用TYR基因特異性引物（表16），按表17的反應(yīng)體系和表18的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR。首先用桑格測序檢測PCR產(chǎn)物是否存在套峰，然后根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)一步做TA克隆鑒定。

表16 靶基因引物

Table 16Primers for target gene

表17 PCR反應(yīng)體系

Table 17 PCR reaction system

 

表18 PCR反應(yīng)條件

Table 18 PCR reaction conditions

4.1.2 脫靶檢測

利用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具（http://crisper.tefor.net/）分析并預(yù)測可能潛在的脫靶位點(diǎn)。針對每條sgRNA分別各選擇10個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)（附表1）。附表1中還列出了檢測潛在脫靶位點(diǎn)所需要的引物。對選擇的潛在脫靶位點(diǎn)分別都進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系參照表17，反應(yīng)條件參考表18，但把退火溫度設(shè)為60℃。所有擴(kuò)增產(chǎn)物的長度約600 bp。并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以確定是否存在脫靶。

4.1.3 石蠟切片制備

組織包埋后做成石蠟切片，可進(jìn)一步用于作各種常見的病理檢查，如蘇木精伊紅染色、銀氨染色、免疫組化等。石蠟切片制備步驟主要如下：

（1）樣本固定：樣本大小應(yīng)以0.5 cm×0.5 cm比較合適，浸泡于10 mL的4%多聚甲醛溶液中室溫固定。若要做免疫組化，則4℃保存。樣本最好充分浸泡一周后才做下一步實(shí)驗(yàn)。

（2）梯度脫水：將固定好的樣品依次放入50%乙醇中浸泡6-8 h，75%乙醇中浸泡6-8 h，85%乙醇中浸泡3-5 h，第一缸95%乙醇中浸泡1-2 h，第二缸95%乙醇中浸泡1-2 h，第一缸100%乙醇中浸泡1 h，第二缸100%乙醇中浸泡1 h。

（3）透明：將脫水好的樣品依次放入1/2乙醇+1/2二甲苯的溶液浸泡1 h，第一缸二甲苯的溶液浸泡1 h，第二缸二甲苯的溶液浸泡1 h。注意：透明時(shí)間長短需要根據(jù)不同組織進(jìn)行調(diào)整，透明過度的話，組織會變得過脆。

（4）浸蠟：將透明好的樣品依次放入1/2二甲苯+1/2石蠟中浸泡1.5 h，第一缸石蠟中浸泡2 h，第二缸石蠟中浸泡2 h。注意：應(yīng)提前熔蠟，且全程不應(yīng)超過65℃。新蠟最好反復(fù)煮熔，去除氣泡，變成老蠟。

（5）包埋：將組織放入模具中，把組織中將來需要切割的面朝下，于包埋機(jī)中包埋并冷卻。

（6）切片：將包好的蠟塊至于切片機(jī)上進(jìn)行修整，并切出需要的切面，做成切片。切片于65℃度烤片3 h以上固定。做好的白切片可一步做染色或免疫組化等。

4.1.4 銀氨核固紅染色

銀氨核固紅染色目的是檢測和觀察組織中黑色素有無表達(dá)和分布。主要步驟有：

（1）脫蠟：將烤好的切片依次在第一缸二甲苯溶液中浸泡5 min，第二缸二甲苯溶液中浸泡5 min，95%乙醇中浸泡3 min，80%乙醇中浸泡3 min，然后蒸餾水中沖洗3 min，浸泡于蒸餾水中備用。

（2）將切片置于氫氧化物銀氨溶液中，在常溫的暗室中放置18 h。

（3）隨后取出并在蒸餾水中快速清洗切片。

（4）置于0.2%氯化金溶液染料中浸泡2 min。

（5）取出在蒸餾水中快速?zèng)_洗。

（6）將切片浸泡在5%硫代硫酸鈉溶液中3 min。

（7）取出切片，用自來水沖洗10 min。

（8）置入核固紅染液中5 min。

（9）自來水沖洗30 s。

（10）脫水、透明、封片：將染色好的切片依次放入第一缸95%乙醇中2 min，第二缸95%乙醇中2 min，第一缸無水乙醇中2 min，第二缸無水乙醇中2 min，第一缸二甲苯中2 min，第二缸二甲苯中2 min。最后用中性樹脂封片。

4.1.5 血樣本采集

采用前腔靜脈采血法，每頭豬分別采取6 mL靜脈血。其中1 mL血置于EDTA抗凝管，搖勻抗凝后，直接用于血液生理檢測。剩余5 mL加入無添加抗凝劑的普通采血管中，室溫靜置40 min，然后置于4℃離心機(jī)，3000 rpm離心30 min。吸取上層血清至新的離心管中，用于血液生化指標(biāo)的測定。

4.1.6 測定體尺指標(biāo)

測量7月齡白化西藏小型豬和普通西藏小型豬的體重、體長、身高、胸圍、管圍等5項(xiàng)指標(biāo)。

4.1.7 統(tǒng)計(jì)繁殖性能

記錄初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬的每窩初生仔數(shù)、斷奶活仔數(shù)，計(jì)算初生活仔率、斷奶活仔率 ADDINNE.Ref.{44AD6311-7ADA-4286-B1C6-BE142C9DECA9}。

4.1.8 測定血液生理學(xué)指標(biāo)

測定白細(xì)胞總數(shù)（WBC，×109/L）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC，×1012/L）、血紅蛋白（HGB，g/L）、紅細(xì)胞比積（HCT，%）、平均紅細(xì)胞體積（MCV，fL）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（MCH，pg）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC，g/L）、血小板總數(shù)（PLT，×109/L）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD，fL）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV，%）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT#，×109/L）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMPH#，×109/L）、中間細(xì)胞計(jì)數(shù)（MONO#，×109/L）、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（EO#，×109/L）、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（BASO#，×109/L）、中性粒細(xì)胞%（NEUT%，%）、淋巴細(xì)胞%（LYMPH%，%）、中間細(xì)胞%（MONO%，%）、嗜酸性粒細(xì)胞%（EO%，%）、嗜堿性粒細(xì)胞%（BASO%，%）等20項(xiàng)。

4.1.9 測定血液生化指標(biāo)

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，U/L）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，U/L）、總蛋白（TP，g/L）、白蛋白（ALB，g/L）、堿性磷酸酶（AKP，U/L）、血糖（GLU，mmol/L）、血尿素氮（BUN，mmol/L）、肌酐（CREA，μmol/L）、鈣（Ca，mmol/L）、磷（PHOS，mmol/L）、總膽固醇（CHOL，mmol/L）、甘油三酯（TG，mmol/L）共12項(xiàng)。各項(xiàng)指標(biāo)檢測方法見表19。

表19 血生化檢測試劑及方法

Table19 Blood biochemical reagents andmethods

4.1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用檢測所得數(shù)據(jù)在IBM SPSS 20.0對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每個(gè)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`x±s ）表示，不同處理因素間進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P值小于0.05為有顯著性差異。

4.2 結(jié)果4.2.1 F0代西藏小型豬的基因型分析及脫靶檢測

本研究對所有F0代仔豬的DNA樣本進(jìn)行桑格測序和TA克隆基因型分析。結(jié)果表明大多數(shù)目的基因位點(diǎn)都存在有不同長度的堿基刪除、插入或堿基替換（表20）。這些位點(diǎn)序列改變后通常導(dǎo)致移碼突變使基因轉(zhuǎn)錄提前終止，或影響所表達(dá)的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致TYR基因功能障礙，黑色素合成受阻。針對每條sgRNA選擇各了十個(gè)潛在的可能脫靶位點(diǎn)（附表1），并利用附表1中所列的引物，對潛在的可能脫靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。檢測并未發(fā)現(xiàn)脫靶。

表20 F0代仔豬的TYR基因型

Table20 TYR genotype of F0 generation piglets

 

注：下劃線標(biāo)記靶向位點(diǎn)。紅色文本表示堿基插入；黃色突出顯示表示堿基突變；（WT）野生型序列；（-）表示堿基刪除；（+）表示插入堿基的數(shù)目；（△）表示刪除堿基的數(shù)目；（→）表示突變堿基。

Note: Underlines marktarget sites. Red text indicates base insertion; yellow highlighting indicatesbase mutation; (-) indicates base deletion; (+) denotes the number of insertedbases; (△) denotes the number of deleted bases; (→) represents the mutant base.

4.2.2 酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬的表型分析

通過觀察F0代仔豬的皮膚和頭發(fā)的顏色，能很好地判斷它們的TYR基因是否被完全敲除。其中有些F0代仔豬呈野生型黑色表型，提示至少攜帶了一個(gè)未被敲除的野生型TYR等位基因（圖5，A中的仔豬a1；圖5，C中的仔豬c10）；有些F0代仔豬呈部分色素缺失，被毛黑白相間，提示TYR基因不完全敲除，為嵌合體（圖5，C中的仔豬c11；圖5，D中的仔豬d13）；有些F0代仔豬呈完全白化表型，提示TYR基因被完全敲除（圖5，A-D中的仔豬a2、a3、a4、b5、b6、b7、b8、c9、c12、d14、d15、d16）。F0代仔豬的所觀察到的被毛顏色表型與其對應(yīng)的TYR基因型是相符的（表4-11）。

TYR-KO西藏小型豬在普通實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境下健康成長，除顏色不一樣外，體型和外貌與WT西藏小型豬幾乎一樣（圖6，A）。從肉眼來看，WT西藏小型豬的眼睛呈黑色，皮膚和被毛也為黑色；而TYR-KO西藏小型豬呈完全白化表型，眼睛呈紅色，皮膚和被毛均為白色（圖6，B）。與野生型相比，TYR-KO西藏小型豬的耳緣靜脈更加清晰（圖6，B）。從病理切片來看，WT西藏小型豬的眼睛鞏膜和睫狀肌均有黑色素分布，而TYR-KO西藏小型豬的虹膜和睫狀肌均無黑色素分布（圖7）；WT西藏小型豬的皮膚真皮層和毛囊均有黑色素分布，而TYR-KO西藏小型豬皮膚真皮層和毛囊均無黑色素表達(dá)（圖8）。

圖6 TYR-KO西藏小型豬與野生型西藏小型豬

（A）成年的TYR-KO西藏小型豬和成年的野生型藏豬；（B）TYR-KO西藏小型豬和野生型藏豬間眼睛和耳朵外觀的比較。

Figure6 TYR-KO Tibet minipigsand wild type Tibet minipigs

(A) Adult TYR-KO Tibet minipigand adult wild type Tibet minipig; (B) Comparison of eye and ear between TYR-KO Tibet minipig and wild type Tibet minipig.

圖7 TYR-KO西藏小型豬與野生型西藏小型豬的眼球病理

切片采用了銀氨核固紅染色。低倍圖像和高倍圖像的標(biāo)尺分別為100μm和50 μm。

Figure7 Eyeball pathology of TYR-KO Tibet minipigs andwild type Tibet minipigs

Sections were stained with ammoniacal silver-nuclear fastred. Scale bars of low and high magnification images are 100 μm and 50 μm,respectively.

圖8 TYR-KO西藏小型豬與野生型西藏小型豬的皮膚病理

切片采用了銀氨核固紅染色。低倍圖像和高倍圖像的標(biāo)尺分別為200μm和100 μm。

Figure8 Skin pathology of TYR-KO Tibet minipigs andwild type Tibet minipigs

Sections were stainedwith ammoniacal silver-nuclear fast red. Scale bars of low and highmagnification images are 200 μm and 100 μm, respectively.

4.2.3 白化西藏小型豬的繁殖育種

通過FO代TYR基因敲除白化西藏小型豬間繁殖，得到了F1代、F2代、F3代白化西藏小型豬。TYR突變白化為常染色體隱性遺傳，因此白化西藏小型豬之間進(jìn)行繁殖，得到的所有子代均呈白化表型（圖9）。

圖9 繁殖所得的子代白化西藏小型豬

Figure 9Offspring albino Tibet minipigs

4.2.4 白化西藏小型豬體尺指標(biāo)測定

我們對白化豬進(jìn)行了繁育，并對后代白化豬進(jìn)行了檢測。由表21可得，7月齡的白化西藏小型豬的體尺指標(biāo)，包括體重、體長、身高、胸圍和管圍，與同齡的普通西藏小型豬之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P >0.05）。白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的各項(xiàng)體尺指標(biāo)的均值基本相似。

表21 白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的體尺指標(biāo)比較（`x±s，n=8 ）

Table 21 Comparison of body size measurements betweenalbino Tibet minipigs and wild type Tibet minipigs (`x±s, n=8 )

注：白化西藏小型豬均為7月齡，雌雄各半；普通西藏小型豬均為7月齡，雌雄各半。 * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: The albino Tibet minipigs wereall 7 months old, half male and half female. Wild type Tibet minipigs are all 7months old, half male and half female. * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.2.5 白化西藏小型母豬繁殖性能測定

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，初產(chǎn)的白化西藏小型豬與初產(chǎn)的普通西藏小型豬之間的各項(xiàng)繁殖性能指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表22），及經(jīng)產(chǎn)的白化西藏小型豬與經(jīng)產(chǎn)的普通西藏小型豬之間的各項(xiàng)繁殖機(jī)能指標(biāo)也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表23）。白化西藏小型豬第一胎初生仔數(shù)約為5.75頭，經(jīng)產(chǎn)白化西藏小型豬的產(chǎn)仔數(shù)增多。

表22 初產(chǎn)白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的繁殖性能指標(biāo)比較（`x±s ）

Table 22 Comparison of reproductiveperformance between primiparous albino Tibet minipigs and primiparous wild typeTibet minipigs (`x±s )

注： * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

表23 經(jīng)產(chǎn)白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的繁殖性能指標(biāo)比較（`x±s ）

Table 23 Comparison of reproductiveperformance between multiparous albino Tibet minipigs and multiparous wild typeTibet minipigs (`x±s )

注： * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.2.6 白化西藏小型豬血液生理指標(biāo)測定

白化西藏小型豬和普通西藏小型豬的血液生理指標(biāo)的測定值經(jīng)統(tǒng)計(jì)（表24），發(fā)現(xiàn)大部分血液生理指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P >0.05）。除了平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度指標(biāo)（MCHC）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P <0.05），白化西藏小型豬的MCHC略高于普通西藏小型豬的MCHC。

表24 白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的血液生理指標(biāo)比較（`x±s，n=12 ）

Table 24Comparison of blood physiological indexes between albino Tibet minipigsand wild type Tibet minipigs (`x±s, n=12 )

注：白化西藏小型豬均達(dá)12月齡，雌雄各半；普通西藏小型豬均達(dá)12月齡，雌雄各半。 * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: AlbinoTibet minipigs were all 12 months old, half male and half female. WT Tibetminipigs are all 12 months old, half male and half female. * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.2.7 白化西藏小型豬血液生化指標(biāo)測定

白化西藏小型豬和普通西藏小型豬的血液生化指標(biāo)的測定值經(jīng)統(tǒng)計(jì)（表25），大部分血液生化指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P >0.05）。除了丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和總蛋白（TP）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P <0.01），白化西藏小型豬的ALT和TP較普通西藏小型豬的測定值低。

表25 白化西藏小型豬與普通西藏小型豬之間的血液生化指標(biāo)比較（`x±s，n=12 ）

Table 25 Comparison of blood biochemical indexesbetween albino Tibet minipigs and wild type Tibet minipigs (`x±s, n=12 )

注：白化西藏小型豬均達(dá)12月齡，雌雄各半；普通西藏小型豬均達(dá)12月齡，雌雄各半。 * 表示P值小于0.05， ** 表示P值小于0.01。

Note: Albino Tibet minipigswere all 12 months old, half male and half female. Wild type Tibet minipigs areall 12 months old, half male and half female. * means P ＜0.05, and ** means P ＜0.01.

4.3 評價(jià)指標(biāo)體系

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物品系：西藏小型豬；

等級：普通級；

動(dòng)物規(guī)格：230-250日齡，雌性，45頭；340-360日齡，雌性，9頭；340-360日齡，雄性，2頭；

出售單位：南方醫(yī)科大學(xué)；

實(shí)驗(yàn)單位：南方醫(yī)科大學(xué)；

倫理審查號：L2016088；

合格證編號：44002100009463；44002100009464；44002100009465；

實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號：SYXK（粵）2011-0074；

許可證號：SCXK（粵）2011-0015。

本研究所用的西藏小型豬均在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會（IACUC）批準(zhǔn)。所有手術(shù)均在麻醉下進(jìn)行，并盡可能減少動(dòng)物的痛苦。

3.1.2 試劑耗材

麥管（0.25 mL，法國，IMV）；

載玻片（7101，國產(chǎn)，帆船牌）；

PZM-3培養(yǎng)液（需配制，表1）；

TCM-199操作液（需配制，表2）；

胚胎水 (W1503，美國，Sigma)；

礦物油（M8410，美國，Sigma）；

Premix Taq（R004A，日本，Takara）；

pMD19-T Vector Cloning Kit（6013，日本，Takara）；

TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（9762，日本，Takara）；Age I限制性內(nèi)切酶（R3552，美國，New England Biolabs）；

Bsa I限制性內(nèi)切酶（R3535，美國，New England Biolabs）；

Phusion 超保真 DNA 聚合酶（M0530，美國，New England Biolabs）；MEGAshortscript T7 kit（AM1354，美國，Life Technologies）；

mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit（AM1345，美國，Life Technologies）；

Cas9表達(dá)載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 （44758，美國，Addgene）；

sgRNA克隆載體pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin（51133，美國，Addgene）；

RNA抽提試劑（酚:氯仿:異戊醇=25:24:1，pH<5.0）（P1011，中國，北京索萊寶科技有限公司）；

DNA抽提試劑（酚:氯仿:異戊醇=25:24:1，pH>7.8）（P1012，國產(chǎn)，北京索萊寶科技有限公司）

質(zhì)粒小提試劑盒（DP103，中國，天根生化科技有限公司）；

血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304，中國，天根生化科技有限公司）；

四烯雌酮（CAS 850-52-2，國產(chǎn)，北京市科益豐生物技術(shù)發(fā)展有限公司）

1%結(jié)晶紫水溶液（G1059，國產(chǎn)，北京索萊寶科技有限公司）

甲醇（分析純，國產(chǎn)，天津市大茂化學(xué)試劑廠）

Dubecco's磷酸緩沖液（P1002，國產(chǎn)，北京索萊寶科技有限公司）

青霉素鉀（國產(chǎn)，成都中牧生物藥業(yè)有限公司）

硫酸鏈霉素（國產(chǎn)，華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司）

手術(shù)切口無菌膜（海殼生，國產(chǎn)，上海海純生物有限公司）

可吸收線（金環(huán)，國產(chǎn)，上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）

常用手術(shù)器械（金鐘，國產(chǎn)，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠）

寵物用留置針（海迪科，國產(chǎn)，山東海迪科醫(yī)用制品有限公司）

毛細(xì)玻璃管（規(guī)格1.0×0.6×100 mm，國產(chǎn)，北京正天易科貿(mào)有限公司）

保溫瓶（SSAM-B1500，國產(chǎn)，上海萬盛保溫容器有限公司）

常用手術(shù)耗材（國產(chǎn)，紗布、棉簽、棉球、碘酊、刀片等）

不同規(guī)格的培養(yǎng)皿、離心管、EP管、吸頭等（美國，Corning）

血液生理分析試劑（日本，Sysmex廠家配套試劑）

血生化檢測試劑（見表19，國產(chǎn)，北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）

3.1.3 儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（3K18，美國，Sigma）

PCR擴(kuò)增儀（PTC 200，美國，Bio-Rad）

凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc EQ，美國，Bio-Rad）

超低溫冰箱（-80℃）（702，美國，Thermo）

紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，美國，Thermo）

高速離心機(jī)（Centrifuge 5418，德國，Eppendorf）

核酸蛋白測定儀（Biophotometer 6131，德國，Eppendorf）

電泳儀（DYY-2C，國產(chǎn)，北京市六一儀器廠）

紫外透射儀（GL-312，國產(chǎn)，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）

電子分析天平（BT224S，國產(chǎn)，賽利多斯科學(xué)儀器有限公司）

生化培養(yǎng)箱（SPX-250B，國產(chǎn)，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

電熱恒溫水浴鍋（HWS12，國產(chǎn)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）

細(xì)菌恒溫?fù)u床（SPH-210A，國產(chǎn)，上海雙旭電子有限公司）

潔凈工作臺（SW-OJ-2FD，國產(chǎn)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）

生物安全臺（HFsafe-1800，國產(chǎn)，上海力申科學(xué)儀器有限公司）

高壓蒸汽消毒器（HVE-50，日本，HIRAYAMA Manufacturing Corporation）

金屬浴（TOMCS BG25，國產(chǎn)，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）

恒溫?zé)崤_（TP-CK05，日本，TOKAT HIT）

拉針儀（P-97，美國，SUTTER INSTRUMENT Company）

煅針儀（MF-900，日本，NARISHIGE Company）

體視顯微鏡（SZX10，日本，OLYMPUS）

顯微注射顯微鏡（CKX41SF，日本，OLYMPUS）

顯微操作儀（TransferMan NK2，德國，Eppendorf）

移液槍（各量程，德國，Eppendorf）

血液分析儀（XT-1800i，日本，Sysmex Corporation）

熒光顯微鏡（BX43，日本，OLYMPUS）

包埋機(jī)（EG1160，德國，Leica）

切片機(jī)（RM2245，德國，Leica）

烘片機(jī)（HI1220，德國，Leica）

攤片機(jī)（HI1210，德國，Leica）

3.1.4 軟件系統(tǒng)

SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件（IBM SPSS 20.0）

Toup View軟件系統(tǒng)（國產(chǎn)，北京拓普視野科技有限公司）

3.1.5 試劑配制

（1）PZM-3培養(yǎng)液配制：

表1 PZM-3胚胎培養(yǎng)液

Table 1 PZM-3 Culture medium

（2）TCM-199操作液配制：

表2 TCM-199操作液

Table 2TCM-199 Manipulation medium

3.2 實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1 設(shè)計(jì)和構(gòu)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)

（1）首先通過Ensembl genome browser數(shù)據(jù)庫了解豬的TYR基因的基因序列（尤其是外顯子序列及編碼區(qū)）及蛋白結(jié)構(gòu)功能，選擇合適的敲除基因位點(diǎn)。注意：不同豬種間的基因序列可能突變差異，應(yīng)以本實(shí)驗(yàn)西藏小型豬的測序結(jié)果為準(zhǔn)，不應(yīng)完全按照網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫。

（2）通過在線網(wǎng)站（http://crispor.tefor.net/）針對西藏小型豬的TYR基因序列設(shè)計(jì)sgRNA。

（3）根據(jù)設(shè)計(jì)的sgRNA序列，設(shè)計(jì)出反向互補(bǔ)的雙鏈，并在雙鏈上分別添加與sgRNA空載連接的接頭，則需成在上鏈的5’端前面添加CCGG，需在下鏈的5’端前面添加AAAC，合成帶接頭的oligos（表3）。

表3 oligos序列

Table 3 Oligossequence

（4）將oligos磷酸化，然后退火形成帶粘性末端的短片段雙鏈DNA。反應(yīng)體系見表4，反應(yīng)條件為：先在37℃中反應(yīng)30 min，然后置于裝有1 L開水的燒杯中煮沸5 min，最后待燒杯中的水自然冷卻至常溫后取出反應(yīng)物。

表4 PNK退火反應(yīng)體系

Table 4-2PNK annealing reaction system

（5）酶切sgRNA克隆載體pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin，酶切反應(yīng)體系按表5，反應(yīng)條件為37℃孵育過夜。

表5 酶切反應(yīng)體系

Table 5Enzymatic reaction system

（6）將步驟5中得到的酶切產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收長片段DNA。

（7）連接構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體，反應(yīng)體系按表6，反應(yīng)條件為16℃孵育30-60 min。

表6 連接反應(yīng)體系

Table 6Connection reaction system

（8）將步驟7的產(chǎn)物直接用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。然后挑取單克隆，送菌液或質(zhì)粒測序（測序引物為U6通用引物，正向測序），根據(jù)測序結(jié)果選取構(gòu)建正確的sgRNA質(zhì)粒。

3.2.2 sgRNA的制備

3.2.2.1 sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板制備

用高保真DNA聚合酶對sgRNA質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物按表8，反應(yīng)體系按照表9，反應(yīng)條件如表10。得到帶T7啟動(dòng)子的sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板后，進(jìn)行2%瓊脂糖膠TBE電泳，判斷條帶大小是否符合預(yù)期：sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板大小為約120 bp。獲得后的體外轉(zhuǎn)錄模板采用苯酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，乙醇和乙酸鈉沉淀純化。

表8 引物序列

Table 8Primer sequence

表9 PCR反應(yīng)體系

Table 9PCR reaction system

注：需要制備6管PCR產(chǎn)物，因?yàn)镻CR產(chǎn)物達(dá)300 μL以上便于進(jìn)行DNA純化。

Note:Six tubes of PCR products need to be prepared, because the PCR products aremore than 300 μL, which is convenient for DNA purification.

表10 PCR反應(yīng)條件

Table 10 PCR reaction conditions

3.2.2.2 sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄和純化

將已純化的sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（MEGAshortscript T7 kit）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。合成的sgRNA經(jīng)核酸純化后才能用于顯微注射。

（1）首先進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成sgRNA，反應(yīng)體系按表11，反應(yīng)條件為37℃，4 h。

表11 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

Table 11 In vitro transcription response system

注：T7 Reaction Buffer需恢復(fù)至常溫才可加入到體系中，否則低溫條件下其成分可引起DNA模板產(chǎn)生沉淀。

Note:T7 reaction buffer can be added to the system only after it is restored tonormal temperature, otherwise, its components can cause DNA template toprecipitate under low temperature.

（1）然后去除DNA模板：加入1 μL TURBO DNase，反應(yīng)條件為37℃，15 min。

（2）最終獲得的sgRNA用苯酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，乙醇和乙酸鈉沉淀純化。

3.2.3 Cas9 mRNA的制備

3.2.3.1線性化質(zhì)粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

酶切酶切反應(yīng)體系見表12，反應(yīng)條件：37℃溫浴，酶切消化過夜。

表12 酶切反應(yīng)體系

Table 12 Enzymatic reaction system

注：要消化至少30 μg的質(zhì)粒才利于下一步做體外轉(zhuǎn)錄模板的純化。酶切產(chǎn)物需取少量進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定，確保酶切完全，所有質(zhì)粒被線性化。

Note: It is necessary to digest at least 30 μg of plasmids forfurther purification of in vitro transcription template. A small amount ofenzyme products need to be identified by agarose electrophoresis to ensurecomplete enzyme digestion and all plasmids are linearized.

3.2.3.2Cas9體外轉(zhuǎn)錄模板的純化

質(zhì)粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9被完全線性化后，為了去除RNA酶和其他雜質(zhì)，采用苯酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，乙醇和乙酸鈉沉淀，純化后作為體外轉(zhuǎn)錄模板。

3.2.3.3體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA

將純化后的Cas9體外轉(zhuǎn)錄模板用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。合成顯微注射用的Cas9 mRNA需要分3步：

（1）首先進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，形成初步的mRNA，反應(yīng)體系參照表13，反應(yīng)條件為37℃，2 h。

表13 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

Table 13 In vitro transcription response system

注意：T7 Reaction Buffer需恢復(fù)至常溫才可加入到體系中，否則低溫條件下其成分可引起DNA模板產(chǎn)生沉淀。

Note:T7 reaction buffer can be added to the system only after it is restored tonormal temperature, otherwise, its components can cause DNA template toprecipitate under low temperature.

（1）去除DNA模板：加入1 μL的TURBODNase，反應(yīng)條件為37℃，15min。

（2）對mRNA加入polyA序列，使mRNA更穩(wěn)定性，反應(yīng)體系參照表14，反應(yīng)條件為37℃，30-45min。

表14 加polyA反應(yīng)體系

Table 14 Add polyA reaction system

注意：反應(yīng)完成后應(yīng)立刻進(jìn)行Cas9 mRNA純化，防止RNA降解。

Note: Cas9 mRNA should be purified immediately after thereaction to prevent RNA degradation.

3.2.3.4Cas9 mRNA的純化

為了去除RNA酶和其他雜質(zhì)，先用苯酚/氯仿/異戊醇抽提RNA，再用乙酸鈉和乙醇沉淀RNA。全程要注意采用無RNA酶的槍頭和手套。最后要加入適量的胚胎水溶解Cas9 mRNA，并分裝于無RNA酶的PCR管中（4 μL/管），-80℃冰箱保存。Cas9 mRNA要保證濃度大于500 ng/μL。

3.2.4 同步發(fā)情

選擇4-7頭健康的性成熟雌性西藏小型豬（7月齡以上）作為供卵母豬，進(jìn)行同步發(fā)情處理。每頭母豬每日早上8點(diǎn)喂服20 mg四烯雌酮口服乳濁液，一日一次，持續(xù)服用18天。停藥后第4天始，每天早晚各觀察發(fā)情一次，大部分母豬會在停藥后5-8天內(nèi)出現(xiàn)發(fā)情。

3.2.5 發(fā)情配種

母豬在停止喂服四烯雌酮后第5天左右開始有發(fā)情跡象，陰道變紅變腫。這時(shí)每天用公豬試情1-2次，誘導(dǎo)母豬發(fā)情更加同步。在上午清潔欄舍前或下午四點(diǎn)左右觀察發(fā)情。西藏小型豬在發(fā)情早期會爬跨其他母豬，圈舍地面較平時(shí)臟亂。當(dāng)西藏小型豬處于發(fā)情中期時(shí)遇公豬會靜立不動(dòng)，此時(shí)人用手按壓其背部，母豬也靜立不動(dòng)。當(dāng)母豬進(jìn)入發(fā)情后期，陰道紅腫會消退，拒絕公豬交配。西藏小型豬單籠飼養(yǎng)時(shí)不易觀察發(fā)情，但母豬發(fā)情時(shí)會表現(xiàn)進(jìn)食減少、煩躁不安。

通過陰道細(xì)胞涂片結(jié)晶紫染色法來判斷母豬是否已達(dá)到最佳發(fā)情狀態(tài)。首先將棉簽輕輕地插入母豬陰道并旋轉(zhuǎn)數(shù)圈。抽出棉簽，將陰道物均勻涂布在載玻片上，并自然晾干（棉簽在玻片上應(yīng)朝一個(gè)方向滾動(dòng)涂布，不可重復(fù)涂布，避免細(xì)胞重疊影響觀察）。然后載玻片用甲醇脫水30 s，并自然晾干。接著結(jié)晶紫溶液染色1 min。最后用清水沖洗3次，并再次晾干，顯微鏡下觀察。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察涂片上的表皮細(xì)胞的大小、形態(tài)及比例等來判斷西藏小型豬的發(fā)情階段。當(dāng)鏡下觀察到大部分細(xì)胞為邊緣皺褶、體積較大且無細(xì)胞核的完全角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞時(shí)，母豬處于最佳發(fā)情狀態(tài)。當(dāng)母豬表現(xiàn)為靜立發(fā)情，且陰道細(xì)胞涂片提示處于最佳發(fā)情階段時(shí)，進(jìn)行配種。采用自然交配方式或人工授精方式進(jìn)行配種。

3.2.6 體內(nèi)沖卵

供卵母豬在配種后16-18 h要進(jìn)行取卵手術(shù)，收集單細(xì)胞期受精卵。具體步驟如下：（1）術(shù)前母豬禁食12 h；（2）靜脈注射戊巴比妥鈉溶液（用量為30-45 mg/kg）進(jìn)行麻醉；（3）下腹部剃毛備皮、清洗、手術(shù)消毒；（4）在下腹鼠蹊部肌間隙處開出4-6 cm手術(shù)切口；（5）將食指和中指從術(shù)口探入腹腔內(nèi)，憑手指觸覺分辨出子宮角（相對于腸而言，子宮角壁較厚一些），用雙指輕輕將其夾出，將卵巢和輸卵管暴露在手術(shù)視野中；（6）將無菌塑料導(dǎo)管的一端從輸卵管傘部天然開口處插入，另一端置至塑料平皿上；（7）在輸卵管子宮角交接處靠近輸卵端輕輕插入一根留置針。同時(shí)用手捏緊靠近子宮角的輸卵管，防止沖卵時(shí)液體進(jìn)入子宮；（8）用注射器將含0.1%牛血清白蛋白的杜氏磷酸鹽緩沖溶液從留置針處推入，液體和胚胎經(jīng)輸卵管從傘部開口沿塑料導(dǎo)管被沖入塑料平皿中；（9）在視顯微鏡下用口吸管撿卵，將卵移至操作液滴中。注意：顯微鏡應(yīng)帶恒溫?zé)崤_，保持38.5℃。

3.2.7 胚胎運(yùn)輸

豬胚胎應(yīng)在38.5℃保持活力，當(dāng)豬卵暴露在低溫環(huán)境中時(shí)極易死亡，采集到的胚胎必須嚴(yán)格恒溫運(yùn)輸。采用簡易裝置進(jìn)行短途運(yùn)輸 ADDINNE.Ref.{77F6BCEF-A63D-4062-9063-977DEDBF0A73}[12]，步驟如下：（1）先用無菌麥管依次吸入：約1 cm的TCM-199操作液液段，約1 cm的空氣段，約1.5 cm含有胚胎的TCM-199操作液液段，約1 cm的空氣段，約1 cm的TCM-199操作液液段；（2）將麥管兩端用燒熱的鉗子封管；（3）將麥管一端固定在泡沫浮標(biāo)中；（4）再將麥管和浮標(biāo)裝入有38.5℃溫水的真空保溫瓶中，并盡快送回實(shí)驗(yàn)室。

3.2.8 胚胎培養(yǎng)

顯微注射前應(yīng)將胚胎放入PZM-3培養(yǎng)基液滴中，在含5% CO2的38.5℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)半小時(shí)以上。注意：PZM-3液滴需要在取卵前一天晚上做好，放入CO2培養(yǎng)箱中平衡12 h才能使用。顯微注射操作時(shí)，將胚胎移至于含TCM-199的操作液中。

3.2.9 顯微注射

配制顯微注射的RNA溶液中，Cas9 mRNA的終濃度是100 ng/μL，每種sgRNA的終濃度均為50 ng/μL。在受精卵處于單細(xì)胞期或二細(xì)胞期時(shí)進(jìn)行胞質(zhì)內(nèi)注射。二細(xì)胞期注射時(shí)，對卵中的每個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行注射。本研究采用的是TransferMan NK2顯微注射操作系統(tǒng)。完成顯微注射后，將胚胎移至平衡好的PZM-3培育基中，于含5% CO2的38.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，再進(jìn)行胚胎移植。

3.2.10 胚胎移植

西藏小型豬胚胎移植通過手術(shù)進(jìn)行。一般每頭代孕母豬移植10～15枚受精卵。對處于發(fā)情期的代孕母豬進(jìn)行麻醉后，剃毛、備皮、消毒、鋪巾。在下腹鼠蹊部開一小口，露出卵巢和輸卵管。將胚胎吸至胚胎移植管，吸入的液體和空氣盡可能少。將胚胎移植管輕輕從輸卵管傘部開口插入，進(jìn)至輸卵管第一個(gè)大彎曲之后。將移植管內(nèi)含胚胎的液體注入輸卵管，并把移植管退出，然后將卵巢和輸卵管放回腹腔，逐層縫合傷口。胚胎移植一般只需移植一側(cè)的輸卵管即可。術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射青霉素和鏈霉素預(yù)防感染。移植后第19～21天及第40天，用豬驗(yàn)孕卡或B超儀檢測是否妊娠，妊娠過程中留意代孕母豬有無返情。

3.3 結(jié)果 利用CRISPR/Cas9受精卵胞質(zhì)注射法制備基因修飾西藏小型豬的基本流程圖3所示。針對TYR基因設(shè)計(jì)了2條sgRNA（圖4）。74枚西藏小型豬受精卵經(jīng)胞質(zhì)內(nèi)注射Cas9 mRNA和sgRNA混合物后，分別移植至7頭代孕母豬身上，其中4頭代孕母豬成功懷孕（分別稱為代孕母豬A、B、C和D，C和D除了TYR基因編輯外，同時(shí)還編輯了其他基因，因而所產(chǎn)的F0代不納入白化保種范圍，只能用于效率統(tǒng)計(jì)）。代孕母豬A、B、C、D各自產(chǎn)下了4頭仔豬。妊娠的代孕母豬都在114天左右自然分娩，沒有發(fā)現(xiàn)妊娠期延長或胎兒發(fā)育落后的現(xiàn)象（表15）。出生的16只F0代仔豬中，公與母的性別比為9:7，產(chǎn)仔數(shù)與移植胚胎數(shù)的比率在33.3%到50%之間（表15）。16只F0代仔豬中有12只（即a2、a3、a4、b5、b6、b7、b8、c9、c12、d14、d15和d16）呈完全白化表型，剩下仔豬a1和c10為黑色表型，而仔豬c11和d13為部分色素缺失表型（圖5，A-D）。

圖3 利用CRISPR/Cas9受精卵胞質(zhì)注射法制備基因修飾西藏小型豬

Figure3 Generating gene-modified Tibetminipigs by CRISPR/Cas9 cytoplasmic injection

圖4 sgRNA設(shè)計(jì)位點(diǎn)示意圖

Figure 4 Schematic diagram of sgRNA design loci.

圖5 F0代仔豬

（A）代孕母豬A產(chǎn)下仔豬a1-a4；（B）代孕母豬B產(chǎn)下仔豬b5-b8；（C）代孕母豬C產(chǎn)下仔豬c9-c12；（D）代孕母豬D產(chǎn)下仔豬d13-d16。

Figure5 F0 generation piglets

(A) Surrogate A gave birthto piglets a1 - a4; (B) Surrogate B gave birthto piglets b5 - b8. (C) Surrogate C gave birthto piglets c9 - c12; (D) Surrogate D gave birthto piglets d13 - d16.

表15 受精卵胞質(zhì)注射法制備基因修飾西藏小型豬

Table15 Generating gene-modified Tibetminipigs by cytoplasmic microinjection

注：C和D進(jìn)行了雙基因編輯，經(jīng)僅供計(jì)算效率，雙基因編輯藏豬不用于后期白化藏豬品系的培育。

西藏小型豬原產(chǎn)于我國青藏高原，是少有的高原型豬種 ADDINNE.Ref.{DFBE4C28-9248-4ECA-94AD-C01D749F38CF}[1]，能適應(yīng)惡劣的高寒氣候和以放牧為主的低劣飼養(yǎng)條件 ADDINNE.Ref.{3FBA4E4C-2B11-4139-920A-BC0F867D6960}[2]，也是我國目前已知小型豬品種中體重最輕的品種之一。2004年顧為望教授等人從中國西藏林芝地區(qū)將藏豬引種到亞熱帶地區(qū)中國廣州，進(jìn)行了風(fēng)土馴化和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究，并正式命名為實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬 ADDINNE.Ref.{BD2173C6-8A46-4DCB-A8B4-52DF31E71172}[3]。

西藏小型豬四肢結(jié)實(shí)緊湊，蹄質(zhì)堅(jiān)硬，被毛多為黑色硬毛，頸部有一直延伸到肩部的鬃毛（圖1）。中國豬品種志記載，成年雌性藏豬體重30.96 kg，體長80.31 cm，體高48.81 cm，胸圍71.74 cm；成年雄性藏豬體重38.30 kg，體長82.58 cm，體高49.83 cm，胸圍77.00 cm ADDINNE.Ref.{088694DB-CBD3-4A28-AEF8-E2E11C0C99CA}[4]。研究發(fā)現(xiàn)藏豬中有18個(gè)與胎盤發(fā)育相關(guān)的基因和39個(gè)與子宮血液循環(huán)相關(guān)的基因得到了快速進(jìn)化，使藏豬能在條件惡劣的高海拔環(huán)境下成功繁殖后代 ADDIN NE.Ref.{7EDC685C-604C-454C-B456-4247515003D7}[5]。與普通家豬相比，藏豬通過減少每胎的產(chǎn)仔數(shù)量（藏豬：4-8頭每胎，家豬：8-10頭每胎），優(yōu)化子宮血液循環(huán)，有效增加氧的利用效率，來產(chǎn)出更強(qiáng)壯的仔豬以適應(yīng)惡劣環(huán)境（仔豬與母豬的體重比例，藏豬：2.83%，家豬：0.57%） ADDIN NE.Ref.{6072F24D-8A45-498A-A5CA-8A98E904C55A}[5]。藏豬有較強(qiáng)的耐寒能力，與胞內(nèi)線粒體產(chǎn)能有著密切的關(guān)系。西藏小型豬線粒體DNA序列具有一定的獨(dú)特性，其線粒體控制區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)具有A型和B型。約有54.9％的西藏小型豬的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列全部為“gtacacgtgc”，稱為A型；約有45.1％的西藏小型豬的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列在靠近3’端為“gtacacgtgc”，而靠近5’端有較多的G→A轉(zhuǎn)換，形成“gtacacatge”和“gtacacgtac”排列或交錯(cuò)排列，稱為B型。而國內(nèi)其他小型豬和在基因庫查詢到的其他豬種的串聯(lián)重復(fù)區(qū)均只有A型，很少發(fā)生變異，B型未見報(bào)道 ADDINNE.Ref.{18F2AA48-B051-4B7C-9644-1342C26B743A}[6]。

實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬

西藏小型豬生長速度慢，耐粗飼，體型勻稱，抗病性和抗逆性好，手術(shù)耐受性強(qiáng)，是較為理想的實(shí)驗(yàn)用小型豬種。但由于西藏小型豬全身被毛和皮膚均為黑色，有時(shí)會影響了某些實(shí)驗(yàn)操作和觀察，如皮膚顏色太深使得耳緣靜脈不清晰，難以順利進(jìn)針，不易于進(jìn)行耳緣靜脈給藥。此外，也不利于對皮膚充血、淤血、出血、炎癥、紅腫、過敏等癥狀的觀察。白化品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如BALB/c小鼠、SD大鼠、新西蘭大白兔、白化豚鼠等，便于實(shí)驗(yàn)操作和觀察，所以更容易受到研究者的喜愛，白化品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更受研究者喜愛。但目前自然界中尚未發(fā)現(xiàn)天然白化的西藏小型豬品種。

動(dòng)物的膚色、毛色和瞳色是由黑色素的合成和分布決定的。黑色素由黑色素細(xì)胞合成，合成后的黑色素一般會聚集形成黑素小體。黑色素有兩種，包括真黑素和褐黑素，可按一定比例混合（圖2）。混合黑色素中，真黑素比例越高，就越呈黑色；而褐黑素比例越高，就越呈紅色。酪氨酸酶基因（tyrosinase gene，TYR）所表達(dá)的酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶（圖2），它的表達(dá)活性決定著黑色素合成的數(shù)量和速度 ADDINNE.Ref.{EE85DA2D-EFC8-4CC8-A8BA-877F9305887B}[7]。皮膚中的黑色素細(xì)胞主要分布于表皮基底層和毛囊。皮膚黑色素可吸收紫外輻射，防止皮膚細(xì)胞受到紫外照射損傷。眼皮膚白化病（oculocutaneous albinism，OCA）是一組遺傳性黑色素合成障礙疾病，其特征是毛發(fā)、皮膚和眼睛的色素沉著普遍減少。全世界各種形式的白化病的患病率差異很大，據(jù)估計(jì)約為1/17000 ADDINNE.Ref.{A25F422B-1149-45C0-890F-DCC1C9A5688B}[8]。OCA臨床上有不同分類，OCA1A是最嚴(yán)重的類型，完全無黑色素合成，而較輕的OCA1B、OCA2、OCA3和OCA4可有一定的色素積累。OCA1、OCA2、OCA3、OCA4分別與TYR、OCA2、TYRP1和MATP基因有關(guān)，四種OCA均為常染色體隱性遺傳病 ADDINNE.Ref.{C1481B98-DE58-4747-AB17-A8B829374EE7}[9]。其中TYR基因發(fā)生突變引起酪氨酸酶功能缺失和減弱，導(dǎo)致黑色素合成障礙，是造成人和其他動(dòng)物白化的常見原因。OCA病人可存在眼睛發(fā)育異常，臨床表現(xiàn)包括不同程度的先天性眼球震顫、虹膜色素減少和半透明、視網(wǎng)膜色素沉著減少、中央凹發(fā)育不全、視敏度降低、屈光不正、色覺障礙和明顯的畏光。其中，中央凹發(fā)育不全和視網(wǎng)膜到視皮層的光感神經(jīng)纖維走行異常 ADDINNE.Ref.{8492C15F-C75F-4349-AD87-26BC2293B073}[10]，可導(dǎo)致斜視和降低立體視覺。佩戴深色眼鏡能減輕眼畏光癥狀。不同類型OCA病人的皮膚和毛發(fā)色素沉著的程度不一樣，皮膚容易因太陽光照射而損傷。OCA患者有正常的壽命、發(fā)育、智力和生育能力。

黑色素的合成

PAH，苯丙氨酸羥化酶；TYR，酪氨酸酶；TRP，酪氨酸酶相關(guān)蛋白。黑色素有兩種，包括真黑素和褐黑素。

為了能讓西藏小型豬更易于實(shí)驗(yàn)觀察和實(shí)驗(yàn)操作，能得到更廣泛的應(yīng)用，本單位利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)受精卵胞質(zhì)內(nèi)注射法定向培育了酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬。白化西藏小型豬全身皮膚和被毛均呈白色，眼睛因缺乏黑色素而呈紅色，呈典型的白化表型，可作為白化病大動(dòng)物模型供臨床研究。白化西藏小型豬的皮膚更加清晰，有利于對皮膚紅腫、出血、淤血、過敏、炎癥、損傷等的觀察，還便于在皮膚或被毛上作清晰的標(biāo)記。經(jīng)統(tǒng)計(jì)白化西藏小型豬的體尺指標(biāo)、繁殖性能、血液生理和生化指標(biāo)等與普通西藏小型豬對應(yīng)指標(biāo)相比，基本上無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P >0.05），適合進(jìn)一步培育成實(shí)驗(yàn)小型豬新品系推廣應(yīng)用。