為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細胞的數(shù)量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結(jié)果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動物模型的制備和應(yīng)用實驗必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實驗室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

TMEM173也稱為STING（IFN基因刺激因子），過表達可激活轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-κB，刺激I型IFN的產(chǎn)生；除了參與RLRs介導(dǎo)的RNA和RNA病毒識別外，STING還作為觸發(fā)dsDNA介導(dǎo)的先天免疫信號分子。STING可作用于一些DNA感應(yīng)器的下游，如DDX41、IFI16和cGAS，用于識別DNA病毒、細菌、寄生蟲和逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA。

F0代構(gòu)建：采用Cas9進行基因定點敲入。

TMEM173也稱為STING（IFN基因刺激因子），起到了適配器的作用，處于RIG-I和MAVS下游，TBK1上游。STING過表達激活轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-κB，刺激I型IFN的產(chǎn)生；抑制內(nèi)源性STING基因則表現(xiàn)出相反的效果。在哺乳動物細胞中，STING是RIG-I通路的關(guān)鍵組成部分。除了RLRs介導(dǎo)的RNA和RNA病毒識別外，STING還作為觸發(fā)dsDNA介導(dǎo)的先天免疫信號分子。STING可作用于一些DNA感應(yīng)器的下游，如DDX41、IFI16和cGAS，用于識別DNA病毒、細菌、寄生蟲和逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA。